Ίχνη ανθρώπινης παρουσίας εντοπίζονται στο νησί από την τέταρτη π.Χ. χιλιετία. Παλαιότεροι κάτοικοί της θεωρούνται οι Πελασγοί. Ακολούθησαν οι Κάρες και οι Λέλεγες. Πρώτος βασιλιάς της Σάμου ήταν ο Αγκαίος, ένας από τους ήρωες της αργοναυτικής εκστρατείας, που έχτισε τον αρχικό ξύλινο ναό της θεάς Ήρας, προστάτισσας του νησιού, κοντά στις εκβολές του Ίμβρασσου ποταμού, όπου κατά τη μυθολογία γεννήθηκε η θεά. Γύρω στον 11ο π.Χ. αιώνα εγκαταστάθηκαν οι Ίωνες με αρχηγούς τον Τεμβρίωνα και τον Προκλή που κυριάρχησαν στο νησί. Αυτοί χώρισαν τη Σάμο σε δυο μέρη, την Αστυπάλαια και την Χησία και έχτισαν την πόλη της Σάμου στο μέρος όπου σήμερα βρίσκεται το Πυθαγόρειο.